【度衡课堂】过敏性试验

定义

过敏反应又称变态反应，是指机体受同一抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫反应，是异常或病理性免疫反应。过敏性试验是观察动物接触受试物后的全身或局部过敏反应。

特点

过敏反应有以下特点：①其组织损伤不同于一般毒性反应，表现为变态反应性炎症；②初次接触抗原后可不出现明显毒性反应，但经过一定时间后再次接触同一物质，即可出现明显反应。③无明显剂量-效应关系，有时很小剂量就可出现剧烈反应。

分类

1963年，Gell与Coombs将过敏反应按其机制分为四类。

I型又称快发或速发过敏型（anaphylactic sensitivity）

由IgE介导。当机体初次接触过敏原后，可产生IgE抗体。通过其Fc段结合于肥大细胞或嗜碱性细胞表面，使机体产生致敏状态。当处于致敏状态的机体再次接触该过敏原时，即与细胞表面的IgE结合，使细胞脱颗粒，并释放多种炎性活性物质，导致毛细血管扩张、通透性增加、腺体分泌增多及平滑肌收缩等一系列病理变化。临床主要表现为荨麻疹、过敏性休克、支气管哮喘、变应性鼻炎、胃肠道与皮肤过敏反应等。

II型又称细胞毒型或溶细胞型（antibody dependent cytotoxic hypersensitivity）

由IgG或IgM介导。主要靶细胞为带抗原的组织细胞，如红细胞、白细胞、血小板、肾小球血管基底膜细胞、皮肤细胞、肝细胞、平滑肌细胞及部分内分泌细胞等。当抗体与靶细胞表面抗原结合后，通过活化补体、巨噬细胞及NK细胞，引起细胞毒作用，导致细胞损伤。主要表现为库姆斯实验阳性的溶血性贫血、粒细胞减少和血小板减少性紫癜。

III型又称免疫复合型或血管炎型（complex-mediated hypersensitivity）

由IgG、IgM介导。由于抗原-抗体复合物在组织中沉积而引发的炎症反应，通过活化补体、嗜中性粒细胞浸润释放出的水解酶，造成组织损伤。主要表现为局限性肺炎、血管炎、狼疮样反应、肾小球肾炎等。

IV型又称迟发型或结核菌素型（cell-mediated hypersensitivity）

由T淋巴细胞介导的过敏反应。当特异性抗原与TD细胞或TK细胞接触后，淋巴细胞致敏产生特异性抗体。当再次接触抗原时，TD细胞即可释放淋巴因子，吸引并激活巨噬细胞，从而引起细胞增殖、浸润，诱发迟发型变态反应。主要表现为接触性皮炎及湿疹。

光敏性包括光毒性（光刺激性）和光过敏性（光变态反应）两类，光毒性是由光诱导的非免疫性的皮肤对光的反应，药物可通过直接作用或通过血循环间接作用。光过敏性是获得性的免疫性介导的由光激活的皮肤对光的反应，系光感物质经皮吸收或通过循环到达皮肤后与吸收的光线在表皮细胞层发生的反应，为IV型过敏反应的特殊类型。

过敏性试验方法

1.主动全身过敏试验（ASA）

基本原理：主动全身过敏试验是给致敏成立的动物静脉注射抗原，观察抗原与IgE抗体结合后导致肥大细胞、嗜碱性细胞脱颗粒、释放活性介质而致的全身性过敏反应。

通常选用体重为300～400克的豚鼠。每组动物数至少6只。设阴性、阳性对照组和受试物不同剂量组，至少包括临床拟用最高剂量或浓度。阴性对照组给予同体积的溶媒，阳性对照组给予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏阳性物质。

选择容易产生抗体的给药途径，如腹腔、静脉或皮下注射，隔日一次，共给药3次，给药体积0.5 ml，末次注射后第14天、第21天分别快速静脉注射致敏剂量的2倍进行攻击。即刻观察动物反应至30分钟，包括症状的出现及消失时间，一般应观察3小时。致敏期间每日观察动物的症状，首末次致敏和激发当日测定动物体重。按表2判断过敏反应发生程度，计算发生率。

表1过敏反应症状

表2 全身致敏性评价标准

2.主动皮肤过敏试验（ACA）

通常选豚鼠。受试物应与临床拟用制剂一致，应为含活性成分和赋形剂或含透皮促进剂的混合制剂。若受试物为膏剂或液体，则一般不稀释；若受试物为固体粉末，则需与适量水或赋形剂混匀，以保证受试物与皮肤的良好接触。当使用赋形剂时，应考虑其对受试物透皮吸收的影响。应设阳性对照和阴性或赋形剂对照。在致敏接触阶段，应充分保证受试物在皮肤的停留时间（6小时）和接触皮肤的范围。第0、第7和第14天，同样方法给药。末次给药后14天，再次给药激发，给药6小时左右后，观察72小时内皮肤过敏反应情况，并按表3评分，按表4计算发生率。同时应观察动物是否有哮喘、站立不稳或休克等全身过敏反应。

表3 皮肤过敏反应程度的评分标准

表4 皮肤致敏性评价标准

3.被动皮肤过敏试验（PCA）

定义及基本原理：被动皮肤过敏实验（PCA）是将致敏动物的血清（内含丰富的IgE抗体）皮内注射于正常动物。IgE与皮肤肥大细胞的Fcδ受体结合，使之被动致敏。当致敏抗原激发时，引起局部肥大细胞释放过敏介质，从而使局部血管的通透性增加，注入染料可渗出于皮丘，形成一个蓝斑。根据蓝斑范围或分光光度计法测定，判定过敏反应程度。

通常选大鼠，可用小鼠，有时根据试验需要用豚鼠，选择动物时应考虑IgE的出现时间。每组动物数至少6只。应设立阴性、阳性对照组和受试物不同剂量组，至少包括临床拟用最大剂量或浓度。阴性对照组应给予同体积的溶媒，阳性对照组给予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏阳性物质。

选择容易产生抗体的给药方法，如静脉、腹腔或皮下注射等，隔日一次，共给药3～5次；末次致敏后第10～14天制备致敏血清。激发时动物备皮处皮内注射合适稀释度的致敏血清0.1mL，24或48小时后，静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等量的0.5%～1%伊文思兰染料共1mL。由于不同种属动物接受含IgE抗体血清后，至能够应答抗原攻击产生过敏反应的时间不同，需注意激发时间选择的合理性。激发注射30分钟后测量皮肤内层的斑点大小，直径大于5mm者为阳性。不规则斑点的直径为长径与短径之和的一半，并提供蓝斑照片。

4.豚鼠Buehler试验（BT）和最大化试验（GPMT）

通常选成年豚鼠。受试物组不少于20只、对照组不少于10只。应设立阴性对照组和阳性对照组。推荐的阳性对照物有巯基苯并噻唑，苯佐卡因，二硝基氯苯，331环氧树脂等，也可以使用其他的阳性对照物，但轻－中度的致敏剂在加佐剂的试验中至少30%和不加佐剂试验中至少15%应有反应。

取决于所选择的方法。在Buehler试验中，致敏剂量应当足够高，以产生轻微的刺激性，激发剂量为不产生刺激性的最高剂量。在GPMT试验中，致敏剂量应足够高以产生轻－中度的皮肤刺激性且能很好地全身耐受，激发剂量为不产生刺激性的最高剂量。第0，6～8和13～15天局部给药诱导，第27～28天在未给药部位给药6小时激发。GMPT试验采用皮内注射给药，使用或者不使用佐剂进行诱导，局部诱导5～8天后，第20～22天给予激发剂量24小时，在去除激发剂量24和48小时后读取结果。两种试验方法均在去除药物24和48小时后读取结果。如结果难以判定，一周后再次激发。

一般在致敏后1和24小时及激发后24和48小时观察皮肤红斑、水肿和其他异常反应，按表5进行评分，计算过敏反应发生率。按表6判断过敏反应强度。可根据毒性反应情况适当调整观察时间。同时测定开始和结束时的动物体重。

表5 皮肤反应评分标准

表6 致敏强度

5.皮肤光过敏反应试验

定义：光过敏性是在局部或全身接触某些药物或化学物后，再暴露于太阳光下可导致类似过敏的反应，属IV型迟发型过敏反应，需要经过诱导及激发阶段。临床表现为急性荨麻疹、持续性湿疹或迟发性疱疹，且经常波及太阳光未照射部位的皮肤。

产生这些作用的药物或化学物，均具有环状结构，吸收光能后成激活状态，并以半抗原形式与皮肤中的蛋白结合成为药物-蛋白质结合物（全抗原），从而刺激抗体产生，经表皮的朗格汉斯细胞呈递给免疫活性细胞，引起过敏反应。其发生时间相对较长，且有一定的潜伏期。通常5~10d的连续用药和光照射可诱导免疫系统产生光过敏反应。再次给药时，药物和光照作用24~48h之内即会有光过敏性反应发生。 

皮肤光敏性试验是根据比较对照组和给药组的反应进行评价。阳性结果时应追加试验，如：与已知阳性物质的比较试验及用其他方法（不加佐剂）进行试验，其中非损伤性试验方法有利于光敏性反应评价。另外，光敏性是光毒性和光过敏性两类混合难分的反应。必要时应追加光毒性试验。试验动物原则上选健康白色豚鼠，每组不少于5只。应设阳性对照药组、阴性对照组和受试物组。

实验方法：

Adjuvant and Strip法：皮内注射FCA、损伤皮肤角质层后涂敷受试物、照射紫外线，以上操作反复5次进行致敏，2周后再次涂敷受试物，照射紫外线激发。

Harber法：涂敷受试物、照射紫外线，此操作隔日一次共3次致敏。3周后再次涂敷受试物，30分钟后照射紫外线激发。

Horio法：涂敷20%月桂醇硫酸钠，再涂敷受试物，立即照射紫外线，此操作每日一次共3次致敏。14天后再次涂敷受试物，照射紫外线激发。

Jordan法：破损皮肤涂敷受试物，1小时后照射紫外线，此操作每周5次，连续3周进行致敏，2周后再涂敷受试物，6小时后照射紫外线，此操作连续2日进行激发。

Maurer法：涂敷受试物，1小时后照射紫外线及可见光线进行致敏。6周和9周后，各3日连续涂敷受试物，30分钟后照射紫外线进行激发。

Morikawa法：为Harber改良法，涂敷受试物，30分钟后照射紫外线，此操作每周连续5天，共2周进行致敏，致敏2周后，涂敷受试物，30分钟后照射紫外线进行激发。

Vinson法：涂敷受试物，照射紫外线，每日一次，连续5次致敏，7～10天后，再次涂敷受试物，照射紫外线激发。

进行何种过敏性试验应根据药物特点、临床适应症、给药方式、过敏反应发生机制、影响因素等确定。

通常局部给药发挥全身作用的药物（如注射剂和透皮吸收剂等）需考察Ⅰ型过敏反应，如注射剂需进行主动全身过敏试验（Active Systemic Anaphylaxis, ASA）和被动皮肤过敏试验（Passive Cutaneous Anaphylaxis, PCA），透皮吸收剂需进行主动皮肤过敏试验（Active Cutaneous Anaphylaxis, ACA）。吸入途径药物应采用豚鼠吸入诱导和刺激试验。粘膜给药应结合受试物的特点参照经皮给药过敏性试验方法进行。如受试物的化学结构与文献报道产生其他过敏反应的化合物相同或相似者建议考虑采取适当的试验方法以考察其是否能引起其他过敏反应（如光过敏性反应等）。Ⅱ和Ⅲ型过敏反应可结合在重复给药毒性试验中观察，如症状、体征、血液系统、免疫系统及相关的病理组织学改变等。经皮给药制剂（包括透皮剂）应进行IV型过敏反应试验，包括豚鼠最大化试验（Guinea-Pig Maximization Test, GPMT）或豚鼠封闭斑贴试验（BuehlerTest）或其他合理的试验方法如小鼠局部淋巴结试验（Murine Local Lymph Node Assay, LLNA）等。

   参考文献

   1.药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则

   2.药物毒理学实验方法与技术

   3.祝戎飞.全身性用药药物皮肤试验浓度选择:ENDA/EAACI药物过敏组指南文件[J].中华临床免疫和变态反应杂志,2017,11(03):291-299.

   4.杨春燕,叶向锋,李超,魏金锋. 制剂安全性试验设计思路及案例分享[C]//.中国毒理学会中药与天然药物毒理与安全性评价第四次（2019年）学术年会论文集.[出版者不详],2019:206-207.